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熒光觀察用什麼物鏡╃·▩?
來源▩•₪:技術文章    釋出時間▩•₪:2022-12-02    瀏覽▩•₪:360次

熒光觀察用什麼物鏡╃·▩?熒光顯微鏡用什麼物鏡

熒光觀察是現代科研·₪▩₪│、生命科學和醫學檢查中都廣泛應用的一種觀察方式│₪•·,那麼熒光觀察用什麼物鏡呢╃·▩?有些老師可能就說要用“熒光物鏡"│₪•·,但“熒光物鏡"到底是什麼意思╃·▩?跟普通物鏡又有什麼區別╃·▩?如果您搞不明白│₪•·,今天這篇文章可以為您解惑╃☁·。


·“熒光物鏡"是什麼╃·▩?


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熒光物鏡


熒光物鏡│₪•·,從字面上來看│₪•·,就是適合熒光觀察的物鏡│₪•·,雖然它的確適合熒光觀察│₪•·,但這並不是它名字來由╃☁·。


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螢石鏡片


熒光物鏡(Fluor)現在的標準稱呼其實是“半復消色差物鏡"(Semi-Apo)或者“平場半復消色差物鏡"│₪•·,因為這種物鏡生產時使用到了螢石(Fluorite)鏡片│₪•·,故稱“螢石物鏡"·₪▩₪│、“熒光物鏡"╃☁·。實際在無限遠光學時代│₪•·,半復消色差物鏡已經可以不用螢石鏡片也能做出來╃☁·。


相比普通物鏡│₪•·,熒光物鏡不僅在熒光觀察中有更好的表現│₪•·,在明場·₪▩₪│、暗場等觀察中│₪•·,它也因為有更高的數值孔徑·₪▩₪│、更強的消色差表現│₪•·,能提供更明亮·₪▩₪│、更高對比度的清晰成像╃☁·。


·基礎知識▩•₪:消色差是什麼╃·▩?

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普通平場消色差物鏡


消色差物鏡(Ach)/平場消色差物鏡(Plan Ach)│₪•·,都是主流│₪•·,這些就是普通物鏡╃☁·。熒光物鏡是半復消色差物鏡/平場半復消色差物鏡│₪•·,與普通物鏡區別在於消色差水平╃☁·。


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白光透過三稜鏡折射出七色光譜


要理解兩者區別│₪•·,首先得搞明白什麼是色差(Chromatic Aberration)╃☁·。陽光可以形成“赤橙黃綠青藍紫"七色彩虹│₪•·,因為它的光譜包含這些顏色╃☁·。


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軸向色差


在透過透鏡時│₪•·,光譜中不同顏色的光會在不同的焦面聚焦│₪•·,藍色在距離透鏡近的距離聚焦│₪•·,綠色還得遠一點│₪•·,紅色離得更遠│₪•·,這意味著紅綠藍三色無法在同個焦面聚焦│₪•·,成像會偏色│₪•·,同時高對比的邊緣會有不聚焦的其他顏色│₪•·,通常呈現為紫邊·₪▩₪│、暈環│₪•·,影響對比度和清晰度│₪•·,這就是軸向色差(Axial Chromatic Aberration).


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橫向色差(光路圖虛線部分)


另一種色差│₪•·,是同一顏色的光透過鏡片中間和鏡片邊緣時│₪•·,會在聚焦面形成不一致的放大效果│₪•·,如中間是1.0倍│₪•·,邊緣可能就是1.3倍│₪•·,這個倍率差異每個顏色都有│₪•·,而且每個顏色的差異不一致│₪•·,其結果就是在成像外圍一圈的成像出現彩色的邊緣│₪•·,這就是放大率色差│₪•·,或者叫橫向色差(Lateral Chromatic Aberration).


軸向色差在成像Z軸│₪•·,橫向色差在成像XY軸│₪•·,前者只能在物鏡層面校正│₪•·,後者的校正方法比較複雜│₪•·,固定筒長和無限遠光學有不同策略│₪•·,不同品牌之間也有差異│₪•·,我們先略過│₪•·,後面再說╃☁·。


·熒光物鏡和普通物鏡區別何在╃·▩?

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消色差鏡組


18世紀│₪•·,光學家John Dollond發明了消色差鏡組│₪•·,將紅藍兩色聚焦到跟綠色焦面相近的焦面│₪•·,從而大大減少了軸向色差│₪•·,提升了清晰度│₪•·,而且他的設計成本夠低│₪•·,因此消色差物鏡自此逐漸成為了望遠鏡和顯微鏡的基本配置│₪•·,直至今天╃☁·。普通消色差設計│₪•·,可以校正紅藍兩色色差│₪•·,以及綠色波段的球差╃☁·。


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熒光物鏡規格對比


熒光物鏡│₪•·,或者說半復消色差物鏡│₪•·,透過引入螢石鏡片等先進材料和更復雜鏡組│₪•·,進一步強化了軸向色差校正能力│₪•·,可以將紅綠藍三色甚至四色聚焦到同一個焦面│₪•·,並校正紅綠藍三色甚至四色的球差╃☁·。


熒光物鏡工作距離較普通消色差更短│₪•·,擁有顯著更高的數值孔徑(N.A)│₪•·,成像更清晰·₪▩₪│、銳利·₪▩₪│、高襯度│₪•·,另外熒光物鏡成像像場普遍達到26.5mm│₪•·,適合搭配25mm超寬視場目鏡│₪•·,比普通消色差18-23mm的視場大一圈│₪•·,在各種鏡檢觀察中│₪•·,你都能明顯體驗到半復消色差相對普通消色差帶來的巨大提升╃☁·。


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高解析度成像通常用APO物鏡


如果加入更多鏡組│₪•·,將色差校正提升到四色或者五色水平│₪•·,就得到復消色差物鏡(APO)了│₪•·,它工作距離更短│₪•·,數值孔徑更高│₪•·,幾乎把整個光譜的色差都給消除了│₪•·,適合各種高解析度成像│₪•·,但對於大部分鏡檢來說│₪•·,從半復消色差到復消色差的提升並沒有那麼巨大│₪•·,因此鏡檢應用中並不普及╃☁·。


需要補充的是│₪•·,熒光物鏡也是有效果差異的│₪•·,有些熒光物鏡的色差校正和球差校正都更強│₪•·,有些則只是強化了球差校正│₪•·,另外即便同樣是熒光物鏡│₪•·,不同鍍膜技術的差異│₪•·,也會讓熒光物鏡在透過率方面出現差距│₪•·,明美高透過率的熒光物鏡在熒光觀察和暗場觀察·₪▩₪│、正交偏光等觀察中更有優勢╃☁·。


·能隨便買個熒光物鏡給自己的顯微鏡升級嗎╃·▩?

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平場消色差物鏡常用於醫院熒光鏡檢


使用熒光物鏡做熒光觀察│₪•·,不僅目視成像背景更暗·₪▩₪│、熒光更明亮清晰│₪•·,相機CCD成像的效果也會清晰銳利╃☁·。那麼對於已有平場消色差物鏡的使用者來說│₪•·,能不能隨便買個熒光物鏡給自己的顯微鏡升級呢╃·▩?


答案是否定的╃☁·。這就需要補充剛剛提到但還沒講完的問題│₪•·,橫向色差的消除╃☁·。


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補償目鏡


在固定筒長的舊時代│₪•·,物鏡的橫向色差問題很難解決│₪•·,廠商的策略是以毒攻毒│₪•·,用同樣有橫向色差│₪•·,但差異率反過來的目鏡進行補償│₪•·,從而實現成像的消色差╃☁·。如果不使用補償目鏡│₪•·,成像畫面的外圍將會非常糟糕╃☁·。


物鏡_12.jpg
明美物鏡採用獨立消色差設計


到固定筒長末期和無限遠光學時代│₪•·,奧林巴斯和尼康終於實現在物鏡層面把橫向色差解決掉│₪•·,稱為“獨立色差校正"│₪•·,而蔡司和萊卡則沿用固定筒長時代的策略│₪•·,將補償橫向色差的任務交給了觀察頭底部的管透鏡和目鏡鏡│₪•·,需使用跟物鏡配套的觀察頭才能消色差╃☁·。明美物鏡採用的是獨立消色差設計│₪•·,更便於實現高質量的顯微相機成像和定製產品開發╃☁·。


無限遠光學時代不同系統之間還有齊焦距離·₪▩₪│、齊軸性和基準焦距等差異│₪•·,不建議使用者自行購買熒光物鏡進行升級│₪•·,以免出現相容問題導致效果不佳或使用體驗不好│₪•·,升級物鏡請聯絡原廠或明美等業的顯微鏡廠家╃☁·。另外明美還提供LED數顯熒光模組│₪•·,適合把無限遠光學的普通顯微鏡升級成熒光顯微鏡│₪•·,包括奧林巴斯CX23正置·₪▩₪│、尼康TS100倒置·₪▩₪│、蔡司V8體視等都可以╃☁·。


總結▩•₪:普通消色差物鏡可以校正紅藍色差和綠球差│₪•·,足夠滿足醫院真菌檢查等常規熒光鏡檢;熒光物鏡(半復消色差物鏡)可以校正紅綠藍三色的色差和球差│₪•·,熒光訊號更強│₪•·,信噪比更高│₪•·,適合FISH熒光原位雜交等高要求的熒光成像╃☁·。同時在偏光·₪▩₪│、暗場等其他觀察方式下│₪•·,熒光物鏡也會有更好的表現│₪•·,前提是升級的物鏡跟機身·₪▩₪│、觀察頭有良好的適配│₪•·,建議找原廠或專業顯微鏡廠家升級╃☁·。



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